ELISA原理 --操作規(guī)則（新手適用）
酶聯(lián)免疫吸附實驗 ELISA
ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個方面： 1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。
一．實驗原理
酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA）是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic techniques）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),ELISA過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）--待測抗體（抗原）--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)物成正比。
用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準(zhǔn)確地定量。
辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素（protonhemin）區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，高可達(dá)3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；
（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；
（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。
二、實驗方法
基本方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
基本方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）
于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
（二） 酶與底物
酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。
免疫技術(shù)常用的酶及其底物
酶 | 底物 | 顯色反應(yīng) | 測定波長 |
辣根過氧化物酶 | 鄰苯二胺 | 橘紅色 | 492* |
四甲替聯(lián)苯胺 | 黃色 | 460** | |
氨基水楊酸 | 棕色 | 449 | |
鄰聯(lián)苯甲安 | 蘭色 | 425 | |
2,2'-連胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）銨鹽 | 藍(lán)綠色 | 642 | |
堿性磷酸酯酶 | 4-硝基酚磷酸鹽（PNP） | 黃色 | 400 |
萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 | 紅色 | 500 | |
葡萄糖氧化酶 | ABTS+HRP+葡萄糖 | 黃色 | 405,420 |
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 | 深藍(lán)色 | ||
β-Ｄ－半乳糖苷酶 | 甲基傘酮基半乳糖苷（4MuG） | 熒光 | 360,450 |
硝基酚半乳糖苷（ONPG） | 黃色 | 420 |
* 終止劑為2mol/L H2SO4
** 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。
可催化下列反應(yīng)： HRP+H2O2→復(fù)合物 復(fù)合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無色底物, 供氫體； A—— 為有色產(chǎn)物。
（三） ELISA常用的四種方法
1．直接法測定抗原
將抗原吸附在載體表面；
加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；
加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．間接法測定抗體
將抗原吸附于固相載體表面；
加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物；
加酶標(biāo)抗體；
加底物。 測定底物的降解量＝抗體量。
3．雙抗體夾心法測定抗原
將抗原免疫種動物獲得的抗體吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;
加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;
加酶標(biāo)抗抗體（第二種動物抗體的抗體）;
加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 競爭法測定抗原
將抗體吸附在固相載體表面;
（1） 加入酶標(biāo)抗原；
（2）,（3）加入酶標(biāo)抗原和待測抗原；
加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
三．儀器和材料
1. 聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板-酶標(biāo)板（平板, 40孔, 96孔）。
2. 酶聯(lián)免疫檢測儀，50ul或100ul加樣器。
3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。
4. 包被液：0.05mol/L PH9.6碳酸鹽緩沖液,4℃保存。 Na2CO3 0.159克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。
5. 稀釋液：同洗滌緩沖液。 【或者牛血清白蛋白(BSA)0.1g加入洗滌緩沖液至100ml；或者加羊/兔血清與洗滌液配成5-10%】
6. 洗滌緩沖液：0.01mol/L PH7.4 PBS-Tween-20, 于４℃保存。 NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20（0.05%）0.5ml。蒸餾水加至1000ml。
7. 封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 鄰苯二胺溶液（底物）：臨用前配制， 0.1M 檸檬酸（2.1g/100ml）6.1ml, 0.2M Na2HPO4·12H2O（ 7 .163g/100ml）6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40ul。
9. 終止液：2mol/L H2SO4。 蒸餾水178.3ml逐滴加入濃硫酸（98%）21.7ml。
四. 操作步驟
1. 包被抗原：用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋, 一般為1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃溫育1小時后，4℃冰箱放置16～18小時。
2. 洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
3. 加封閉液200微升，37℃放置一小時。
4. 洗滌同2。
5. 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,，每孔200微升。同時作稀釋液對照。37℃放置2小時。
6. 洗滌同2。
7. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時。
8. 洗滌同2。
9. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10--15分鐘。
10. 加終止液：每孔50微升。
11. 觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù)。
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