miRNA-熒光定量檢測服務(wù)

更新時間：2024-09-26

簡要描述：

miRNA-熒光定量檢測服務(wù)是一類長度約19-24nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或互補，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達的作用。它廣泛存在于動物、植物、真菌及病毒的基因組中，調(diào)控生物體生長發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中相關(guān)基因的表達。

　　miRNA-熒光定量檢測服務(wù)（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度?？捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達量的檢測。

　　MicroRNA（miRNA）是一類長度約19-24nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或*互補，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達的作用。它廣泛存在于動物、植物、真菌及病毒的基因組中，調(diào)控生物體生長發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中相關(guān)基因的表達。miRNA的異常表達可能會導(dǎo)致生理狀態(tài)的異常和疾病的產(chǎn)生，在多種癌癥中，miRNA的表達水平會發(fā)生明顯改變，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外，在許多其他的病變組織和細胞中也檢測到了miRNA的異常表達。因此對miRNA的表達的研究具有重要意義。

miRNA-熒光定量檢測服務(wù)常有兩種檢測方法

　　1）探針法

　　PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

　　2）miRNA熒光定量檢測服務(wù)染料嵌入法

　　使用熒光染料SYBR或EVGreen。熒光染料可以結(jié)合到雙鏈DNA上面，當體系中的模板被擴增時，熒光染料可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進行，結(jié)合的熒光染料越來越多，被儀器檢測到的熒光信號越來越強，從而達到定量的目的。

miRNA熒光定量檢測服務(wù)

　　1）引物設(shè)計

　　2）RNA提取

　　3）RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

　　4）real time PCR 反應(yīng)

　　5）數(shù)據(jù)分析

miRNA熒光定量檢測服務(wù)結(jié)果

　　基因表達量變化的直方圖、熱圖等，miRNA熒光定量檢測服務(wù)是功能研究的基礎(chǔ)，鎖定關(guān)鍵目標，找到深入研究的方向?qū)ρ芯恐陵P(guān)重要。

　　是一類長度約19-24nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或*互補，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達的作用。它廣泛存在于動物、植物、真菌及病毒的基因組中，調(diào)控生物體生長發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中相關(guān)基因的表達。miRNA的異常表達可能會導(dǎo)致生理狀態(tài)的異常和疾病的產(chǎn)生，在多種癌癥中，miRNA的表達水平會發(fā)生明顯改變，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外，在許多其他的病變組織和細胞中也檢測到了miRNA的異常表達。因此對miRNA的表達的研究具有重要意義。

　　1）樣品提供

　　a.RNA樣品：取適量新鮮組織，勻漿后抽提總RNA，并提供RNA質(zhì)量檢測圖。

　　b.組織樣品：取適量（50-100mg）液氮保存的組織。

　　c.血液樣品：加凝固劑并離心，取血清、血漿或全血進行分析。

　　d.細胞樣品：取107個細胞，吸去培養(yǎng)液后用TRIZOL試劑抽提RNA。

　　提供實驗報告、詳細的實驗方法、實時熒光定量PCR實驗結(jié)果、圖表及相關(guān)分析數(shù)據(jù)。

miRNA熒光定量檢測服務(wù)中的miRNA是如何產(chǎn)生的？

　　miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運輸?shù)郊毎|(zhì)，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對不*互補的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，因而每個 miRNA 可以有多個靶基因，而幾個 miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個 miRNA 來經(jīng)濟地調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個 miRNAs 的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。對于基于 miRNA 調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

miRNA熒光定量檢測服務(wù)基本原理

　　實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速、高重復(fù)性地定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個核苷酸組成的小RNA，長度太短，并不能通過傳統(tǒng)的實時定量PCR進行檢測,但是通過特殊設(shè)計的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實時定量PCR引物及探針可以檢測微量樣品中microRNA表達水平，也可以用終點PCR法定性檢測。

　　雖然 microRNA 實時定量PCR是一種zui近才發(fā)展起來的檢測技術(shù)，其技術(shù)細節(jié)還在不斷完善中,但是microRNA 實時定量PCR檢測系統(tǒng)，相對其它microRNA檢測技術(shù)有以下優(yōu)點：

　　1.高特異性 , 可以只對成熟 microRNA 進行定量，有效區(qū)分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；

　　2.快速，簡單，省時，整個操作只需兩步，不到 3 個小時，即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)；

　　3.檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需 1-10ng 的總 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；

　　4.超寬的線性范圍，可跨越 7 個數(shù)量級；

樣品保存及運輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的RNA會開始降解。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周，不會有明顯的RNA降解發(fā)生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個月，不會有明顯的RNA降解發(fā)生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩(wěn)定保存3～5年。